Em suas campanhas de conquista de novas terras e alianças ou subjugação dos índios, Balboa soube da existência ao sul de um grande mar e de uma grande terra, onde havia abundância de ouro (talvez o Império Inca do Peru).

Após esta notícia, Balboa organizou uma expedição com 190 espanhóis (incluindo Francisco Pizarro) e 800 índios que, primeiro, atravessou o istmo do Panamá. O rei espanhol nomeou-o governador em exercício de Darien, uma posição que ocupou até a chegada de Pedrarias em 1514.

Em Darien, Balboa ganhou a lealdade e respeito dos indígenas de Santa Maria. Como resultado, conseguiu descobrir o Mar do Sul. Em 25 de setembro de 1513, avistou o mar cobiçado, que ele chamou de Mar del Sur por causa da direção seguida pela expedição do ponto de partida, mas foi mais tarde chamado o Oceano Pacífico por Fernão de Magalhães (1520) por causa dos suaves ventos alísios que sopram na região. Depois de tomar posse do mar em nome da Espanha, Balboa e seus homens retornaram para Darien em janeiro de 1514.